摘要：昆虫肠道菌因其数量和种类的多样性而成为新颖天然产物的广泛来源，本活动通过分离与培养负蝗肠道菌，发现该肠道菌经小量液体发酵后获得的菌液对稗草种子生长有97.3%的抑制率，在拓展学生微生物实验技能的同时，也帮助学生探究了昆虫和肠道菌二者的互利共生关系。 
中国论文网 http://www.xzbu.com/8/view-5933367.htm
　　关键词：负蝗 肠道菌 除草活性 种间关系 
　　中图分类号：G633.91 文献标识码：B 
　　1、引言 
　　昆虫肠道内栖息着的微生物不仅数量庞大，又因昆虫的类别以及肠道结构的多样性，其种类也特别丰富，昆虫和肠道菌二者之间存在着广泛、非致病的共生关系。本研究主要内容为分离负蝗肠道菌，并探究该菌株代谢产物的除草活性，是学生在学习人教版高中生物选修l“微生物的培养技术”后，对该技能的应用与拓展。此外，学生通过必修3“生物的群落”一课的学习，知晓互利共生关系作是一种重要的种间关系，但中学阶段尚缺少相关适宜的探究或验证性实验，而中负蝗与其肠道菌之间作为共生关系的一个例证，能为高中生物教师开展探究种间共生关系的实验活动提供参考思路。 
　　2、实验原理 
　　负蝗是直翅目蝗科的一种较常见昆虫，为农业害虫，可在草丛以及稻、麦、高粱、玉米等作物间发现。负蝗肠道内栖息着一种叫做弯孢菌的微生物，它产生的根匍柄菌素和邻苯二甲酸正丁异丁酯两种化合物具有显著的除草活性和抗真菌活性。本实验需解剖负蝗肠道，研磨并稀释10倍，经涂布平板法获得肠道菌，再通过小量的液体发酵，因其发酵液中含有该肠道菌上述的两种代谢产物，通过培养皿生物分析法便可测其除草活性。 
　　3、实验材料和器具 
　　实验材料：负蝗、稗草种子、生麦芽、葡萄糖、蛋白胨、琼脂、无菌水。 
　　实验器具：解剖刀、镊子、研钵、试管、搪瓷杯、三角锥瓶、纱布、滤纸片、无菌操作台、高压蒸汽灭菌锅。 
　　4、实验方法 
　　麦芽培养基的配置：称量20 g的生麦芽置于搪瓷杯内，加入300 mL的水，沸煮15 min，再将汁液经纱布过滤到大烧杯中，剩余的麦芽再重复沸煮l 5 min，将两次汁液混合，再加入20 g葡萄糖、1 g蛋白胨、15～20 g琼脂，加水至1 000 mL。培养基及相关器皿需经高压蒸汽灭菌锅121℃下灭菌15 min。发酵用的麦芽培养液的配置方法相似，不加琼脂即可，需在使用当天提前配置。 
　　负蝗肠道菌的分离：将负蝗饥饿处理24 h后，在无菌超净台上操作，用体积分数为70%酒精表面消毒2 min，无菌水漂洗3次，用无菌解剖刀和无菌镊子解剖出负蝗肠道，放在无菌研钵中加入2 mL无菌水研磨均匀，取0.2 mL稀释液涂布于麦芽培养基平板表面，平行涂布三皿，待稀释液充分被吸收后，在28℃恒温箱中倒置培养3～4 d至肠道菌充分生长。 
　　肠道菌的发酵：挑选菌株长势良好一皿，在无菌操作台内操作，用解剖刀在布满肠道菌的培养板上划上多条横竖线，然后将培养基挖块接种到2～3瓶装有150 mL麦芽培养液的锥形瓶中，置于温度为28 ℃、转速为180 r/min的摇床中培养7 d（若没有摇床，可以采用定时摇晃锥形瓶的方法）。将发酵液经纱布过滤后便得到含该菌株代谢产物的菌液。 
　　除草活性实验：采用培养皿生物分析法，取稗草种子放入含有少量蒸馏水的培养皿中，28℃的培养箱中催芽培养2～3 d至种子露白备用。取一片滤纸片放于培养皿中，加入5 mL的菌液，使滤纸片均匀浸透。然后在培养皿中放入根部露白但未有生长长度的15颗稗草种子，根部朝下放置浸润于菌液中。平行处理3次，另取5 mL的无菌蒸馏水代替菌液重复以上步骤做空白对照。再一起置于28℃的培养箱中培养2～3 d，测定根长，求出菌液对稗草种子生长的抑制率。 
　　5、实验结果与讨论 
　　负蝗肠道菌株的分离结果：实验从负蝗肠道中分离得到的菌株其菌落在28℃时的麦芽培养基上生长很快，在4 d内能都覆盖整个平板（直径9 am），颜色呈灰褐色或灰绿色。 
　　除草活性实验结果：是从对照组培养皿中随机取出的一颗稗草种子，发现其根部长势良好，根长为18.7 mm；从实验组随机取出的稗草种子，其根部未生长，仍处于刚露白的状态。通过测量所有种子的根长，发现实验组的45颗种子，只有少数几颗有生长，平均每颗根长为0.7 mm，而对照组稗草种子的平均根长为19.3 mm，此次实验中负蝗肠道菌菌液对稗草生长的抑制率为96.4%。 
　　6、结论 
　　已有研究表明，一些以植物为食的昆虫其体内的肠道菌能合成一定的植物毒素，杀死植物以利于昆虫消化。而本实验的结果显示，经液体发酵后负蝗肠道菌的菌液能显著抑制稗草种子生长，抑制率达到97.3%。分析其主要原因应是文献中所述的含有根匍柄菌素等除草活性物质，从而表明负蝗和其肠道菌确实存在着互利共生的关系。通过本实验，学生在提高实验操作技能和探究能力以及深入理解种间关系的同时，还能进一步思考在当今化学合成除草剂遇到研发率低且对人类生存环境带来破坏的背景下，是否可从昆虫肠道微生物中探寻天然除草剂的踪迹，实现对环境的绿色无污染目标。